N-nitrosaminas ou Nitrosaminas são formadas a partir da reação de um grupo amino (NH) e um agente nitrosante (NOx), em condições reacionais adequadas, resultando em grupamentos funcionais caracterizados quimicamente como N-nitrosos (N-N=O) (Beard e Swager, 2021).
Uma das vias mais comuns de formação de nitrosaminas na indústria farmacêutica, ocorre em meio ácido pela formação do íon nitrosônio (NO+), proveniente do ácido nitroso. Esse íon é atacado por uma amina, levando a formação da nitrosamina subsequente. Outra possibilidade ocorre por meio da reação de nitrito de sódio com íons H3O+ (em meio ácido), para a formação do ácido nitroso, que ao se decompor em íon nitrosônio (eletrófilo), é atacado pela amina (nucleófilo), levando a formação da nitrosamina (Figura 1).
Figura 1. Mecanismo de formação de nitrosaminas em meio ácido.
Além da nitrosação via nitritos em meio ácido, várias outras formas de nitrosação devem ser consideradas na análise de risco, como: N-cloroaminas e íons nitrosônio, pelas reações entre hidrazinas, acetohidrazinas e agentes oxidantes; uso de sais quaternários de amônio; bem como as reações entre vinil hidrazinas e ozônio, N-nitramidas e agentes redutores.
Aminas e agentes nitrosantes podem ser oriundos de diferentes fontes, sendo desde os materiais de partida, produtos intermediários, bem como no próprio IFA. E ainda, produtos de degradação e por contaminação cruzada a partir da linha de produção compartilhada, oriundos de excipientes, ou mesmo por estocagem, permitindo a interação entre princípio ativo e componentes da embalagem, como plástico, tinta de impressão, entre outros.
Nitrosaminas podem ser categorizadas como de baixo peso molecular ou pequenas, bem como aquelas derivadas da estrutura do IFA, as quais são consideradas de alto peso molecular (Figura 2).
Figura 2. Nitrosaminas de baixo peso molecular (esquerda) e de alto peso molecular (direita).
Nitrosaminas podem ser primárias, secundarias, ou ainda, terciárias, a depender da amina da qual for derivada. Quimicamente, as primárias são instáveis e, se decompõem com facilidade, não acarretando riscos de toxicidade no organismo. Enquanto a nitrosação de aminas secundárias e terciárias, por outro lado, pode levar a formação de compostos com elevado potencial mutagênico e carcinogênico.
Qual a importância do controle das nitrosaminas?
Esses compostos são conhecidos toxicologicamente como agentes alquilantes de DNA. Uma vez metabolizadas no organismo, pelas enzimas do citocromo P450 (NADPH O2 dependente), sofrem α-hidroxilação e, posteriormente, a formação do íon diazônio correspondente. Esse íon reage com o DNA durante a replicação, levando a alquilação e mutagenicidade, e possível formação de câncer (Li e Hecht, 2022) (Figura 3).
Figura 3. Mecanismo de metabolização de nitrosaminas, via alfa-hidroxilação, e, consequente, alquilação do DNA.
Assim, as nitrosaminas são classificadas como grupo de preocupação pelo ICH M7, uma vez que causam mutagenicidade em níveis muito inferiores ao limite de preocupação toxicológica (TTC) estabelecido para substâncias conhecidamente mutagênicas. Enquanto o TTC geral é de 1,5 ug/g, o limite toxicológico das nitrosaminas encontra-se na escala de ng/g, chegando a valores de até 8,0 ng/dia (Tabela 1).
Tabela 1. Limites estabelecidos para nitrosaminas nos principais guias internacionais.
| LIMITES | |||||
| NITROSAMINA | ESTRUTURA | EMA | FDA | ANVISA | HCAN |
| NMPEA N-methyl-N-nitroso-phenethylamine | 8,0 | – | 8,0 | – | |
| NDPA N-nitrosodipropylamine | 26,5 | – | 26,5 | 26,5 | |
| NMOR N-nitroso-morpholine | 127,0 | – | 127,0 | 127,0 | |
| NDEA N-nitrosodiethylamine | 26,5 | 26,5 | 26,5 | 26,5 | |
| NDMA N-nitrosodimethylamine | 96,0 | 96,0 | 96,0 | 96,0 | |
| NMPA N-nitroso-N-methylaniline | 100,0 | 26,5 | 34,3 | 26,5 | |
Qual o contexto farmacêutico?
No cenário da indústria farmacêutica, em 2018, as agências Food and Drug Administration (FDA) e a European Medicines Agency (EMA) anunciaram a detecção de nitrosaminas tóxicas (NDMA e NDEA) em medicamentos da classe das sartanas, as quais são amplamente utilizadas no tratamento da hipertensão. E desde então, as empresas passaram a ter obrigatoriedade de gerenciar o risco de formação das nitrosaminas e se necessário seguir com a identificação e controle dessas substâncias em medicamentos, bem como insumos farmacêuticos. Atualmente a legislação nacional também regulamenta esse tipo de impurezas pela RDC 677/22 e Guia 50/2021, versão 4. Uma linha do tempo do panorama regulatório das nitrosaminas é apresentado a seguir, Figura 4.
Figura 4. Linha do tempo do panorama regulatório de nitrosaminas.
A RDC 677/22 da ANVISA, traz como matriz de risco a seguinte classificação para os produtos do portifólio: “muito alto”, “alto”, “médio”, “baixo” e “muito baixo”. Sendo que, atualmente, estamos no 3º marco da transição, ou seja, com prazo de até 2 de junho de 2025 para avaliação de risco de todos os produtos do portfólio.
Recentemente, em agosto de 2024, saiu a versão 04 do guia 50/2021, no qual os limites das principais nitrosaminas foram atualizados em conformidade com as autoridades EMA, FDA e Health Canada, juntamente com a abordagem por CPCA. Adicionalmente, foram descritas as condições para a execução do teste de Ames otimizado para N-nitrosaminas.
Quais as etapas de controle?
Diante desse cenário de elevado risco toxicológico, passou a ser necessário e obrigatório a avalição de risco de nitrosaminas em medicamentos e insumos farmacêuticos.
A avaliação de risco requeridas pelas agências regulatórias consiste nas seguintes fases:
Fase 1: é realizada a avaliação teórica do potencial risco de presença e formação de nitrosminas, conforme o escopo da Figura 5.
Figura 5. Fatores para avaliação de risco. Fonte: Guia 50, 2021, versão 2.
Fase 2: quando é identificado risco potencial de presença de nitrosaminas como resultado da fase 1, devem ser realizados testes confirmatórios, a fim de confirmar ou refutar a presença a hipótese. Nessa fase, o desafio para identificar e quantificar quantidades muito baixas requer métodos analíticos altamente sensíveis e robustos.
Fase 3: está associada a definir a estratégia de controle, com a inclusão de testes e providenciar mudanças pós-registro, conforme estabelecido pela normativa da RDC 677/2022.
O time da Science Consult é altamente capacitado para conduzir todo o processo de avaliação de nitrosaminas, desde a identificação do risco, desenvolvimento de metodologias analíticas, bem como estratégias regulatórias de acordo com a necessidade da sua empresa.
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PhD. Edione Canzi Westin
Especialista em desenvolvimento analítico e documentação técnica